Часть iiiОчистка продуктов пцр

Пробирка быстро наполняется множеством копий 16SрДНК, всего около 1500 изначальных пар В это время разумно начать делать гель подтверждающий работу ПЦР реакции. Гель будет состоять из трех дорожек: первая – отрицательный контроль (то есть вода), которая не будет содержать продукта, при условии, что она не загрязнена; другой – положительный контроль (ПЦР продукт известной цепочки ДНК) для подтверждения, что реакция ПЦР выполнена; и последняя дорожка для исследуемой пробы. Если Вы уверенны, что ПЦР прошла успешно, то можете начинать процесс очистки продуктов ПЦР. Работа с гелем фактически является первым шагом к очистке. Когда ПЦР продукт в геле, вы можете вырезать соответствующие участки продукта ПЦР и изолировать ДНК из геля. В настоящее время Вы можете купить компактный микрофильтр отфильтровывающий ДНК из ПЦР пробирки без использования геля. В нашем опыте мы будем использовать такую микроконцентрационную колонну:

1. Возьмем микроконцентрационную колонну по размеру подходящую к пробирке.

2. Добавим 400 мкл буферного раствора в колонну.

3. Добавим чистое содержимое ПЦР (около 100 мкл) в колонну.

4. отцентрифугируем при скорости 3000 об./мин. На угловой центрифуге 15 минут.

5. ПЦР продукт останется в колонне, в то время как праймеры, нуклеотиды и прочие мелкие компоненты в которых нет необходимости сконцентрируются в пробирке.

6. перевернем колонну и прикрепим к новой концентрационной пробирке.

7. Добавим 50 мкл буферного раствора в перевернутую колонну. Этот шаг нужен для смыва ДНК из концентрационной колонны в пробирку.

8. Центрифугируем перевернутую колонну со скоростью 3000 об/мин. – 2 минуты. Для сбора образца в конценрационной пробирке. Извлекаем колонну.

В итоге концентрационная пробирка содержит множество кусочков от 1500 определенной длинны 16SрДНК с множеством мало значимый крупных цепочек ДНК (которые являются примесями).